Paper DNA Barcode lithobates catsbaena

Peningkatan spesies invasif asing melalui deteksi barcode DNA lingkungan:Amerika bullfrog Lithobates catesbeianus Ringkasan 1. spesies invasif Alien (SIA) adalah salah satu penyebab utama hilangnya keanekaragaman hayati dan homogenisasi global. Setelah SIA menjadi mapan, biaya kontrol bisa sangat tinggi dan lengkap pemberantasan tidak selalu tercapai. Kemampuan untuk mendeteksi spesies dengan kepadatan rendah sangat meningkatkan keberhasilan pemberantasan dan mengurangi baik biaya kontrol dan dampaknya terhadap ekosistem. 2. Dalam studi ini, kita membandingkan sensitivitas metode lapangan tradisional, berdasarkan survei pertemuan pendengaran dan visual, dengan DNA lingkungan (EDNA) survei untuk deteksi katak Rana catesbeiana Amerika = Lithobates catesbeianus, yang invasif di selatan-barat Perancis. 3. Kami menunjukkan bahwa metode EDNA berharga untuk deteksi spesies dan melampaui metode survei amfibi tradisional dalam hal sensitivitas dan usaha sampling. Bullfrog yang terdeteksi pada 38 situs dengan menggunakan metode molekuler, dibandingkan dengan tujuh lokasi dengan menggunakan survei diurnal dan nokturnal, menunjukkan bahwa survei lapangan tradisional sangat meremehkan distribusi katak American. 4. Sintesis dan aplikasi. Pendekatan DNA lingkungan memungkinkan deteksi dini spesies invasif asing (AIS), dengan kepadatan yang sangat rendah dan pada setiap tahap kehidupan, yang sangat penting untuk mendeteksi spesies akuatik yang langka dan/atau rahasia. Metode ini juga dapat digunakan untuk mengkonfirmasi sensitivitas operasi kontrol dan untuk lebih mengidentifikasi distribusi spesies yang rentan, membuat ini alat yang sangat relevan untuk persediaan spesies dan manajemen. Kunci-kata: spesies invasif asing, barcode DNA, DNA lingkungan, persediaan, Lithobates catesbeianus, deteksi spesies Pengantar Spesies invasif asing (SIA) merupakan salah satu penyebab utama hilangnya keanekaragaman hayati dan homogenisasi global (Vitousek et al. 1997; Ficetola, Thuiller & Miaud 2007b; Ehrenfeld 2010; Pysek & Richardson 2010). Mereka mungkin keluar-bersaing spesies asli, bertindak sebagai predator atau menyebarkan penyakit eksotis. Misalnya, dalam 1991, 68% dari ikan air tawar di daratan Amerika Serikat diketahui telah punah sejak tahun 1890 yang terkena dampak negatif oleh memperkenalkan ikan non-pribumi (Wilcove & Bean 1994). Sekali SIA menjadi mapan, biaya tindakan kontrol dapat sangat tinggi, pemberantasan lengkap tidak bisa selalu dicapai (Howald et al. 2007) dan hal ini dapat mempengaruhi secara negatif lingkungan dan kompromi pemulihan spesies asli (Myers et al. 2000). Selama tahap awal AIS pengenalan, deteksi spesies tidak mungkin kecuali kepadatan melebihi tertentu threshold (Hulme 2006; Harvey, Qureshi & MacIsaac 2009). Ambang batas deteksi tergantung pada metode pemantauan digunakan dan deteksi spesies hanya dapat dibuat setelah spesies sudah mapan (Myers et al. 2000). Kemampuan untuk mendeteksi AIS dengan kepadatan rendah sangat menentukan keberhasilan dari operasi pemberantasan, mengurangi biaya pengendalian dan mengurangi dampak pada ekosistem (Mehta et al. 2007). Oleh karena itu, ada kebutuhan mendesak untuk metode yang meningkatkan probabilitas deteksi (Harvey, Qureshi & MacIsaac 2009). Berasal dari Timur Amerika Utara, Amerika bullfrog telah diperkenalkan di seluruh dunia (Lever 2003). Hal ini dianggap menjadi salah satu dari 100 spesies invasif terburuk di dunia (Lowe et al. 2000; D'Amore 2012). Di Eropa, katak telah diperkenalkan setidaknya 25 negara selama abad ke-20 (Ficetola et al. 2007a). Tiga populasi yang berhasil didirikan di Perancis (Gbr. 1), dan dua di antaranya adalah subjek untuk mengontrol tindakan terdiri dari penghapusan massa telur, kecebong perangkap dan menembak remaja dan dewasa (DEJEAN 2008). Dalam populasi ditetapkan di selatan-barat Perancis (Dordogne), katak yang terdeteksi di 35 badan air pada tahun 2006 dengan menggunakan survei tradisional teknik (panggilan dan pertemuan visual yang survei, Dodd 2010). Tindakan kontrol dimulai pada tahun 2006 dan katak terdeteksi di 19 lokasi air pada tahun 2007 dan tujuh lokasi pada tahun 2008 (Guibert, DEJEAN & Hippolyte 2010). Tindakan pengendalian tampaknya mengurangi kepadatan katak, tetapi hubungan antara amfibi probabilitas deteksi dan kepadatan menunjukkan bahwa populasi kecil lebih mungkin untuk menghindari deteksi (Tanadini & Schmidt 2011). Probabilitas deteksi populasi low-density dapat ditingkatkan dengan meningkatkan upaya sampling (yaitu peningkatan jumlah kunjungan per situs). Dalam studi ini, kami mengusulkan untuk menggunakan DNA lingkungan baru dikembangkan (Edna) barcode Pendekatan (Hebert et al 2003;. Ficetola et al 2008;. Valentini Gambar. 1. Distribusi populasi katak diperkenalkan di Perancis. 1:Daerah jajahan di Gironde (pengenalan pada tahun 1968), 2: wilayah terjajah di Dordogne (pengenalan pada tahun 1990). Penelitian ini dilakukan dalam daerah (lihat Gambar. 2). 3: wilayah terjajah di Loir et Cher (pengenalan dicurigai di tahun 2000). Perbandingan biaya antara tradisional dan DNA lingkungan (Edna) survei dilakukan dalam daerah (lihat Diskusi). (Peta baik yang diberikan oleh J. Lescure dan J.-C. deMassary). Pompanon & Taberlet 2009), dengan menggunakan sampel air sebagai DNA sumber. Metode ini telah berhasil diterapkan di deteksi invasif (Ficetola et al 2008;.. Jerde et al 2011) atau spesies rahasia (Goldberg et al. 2011). Kami membandingkan dan mempertimbangkan potensi kesalahan dari kedua metode (survei dan Edna). Bahan dan metode STUDI AREA Penelitian ini dilakukan dalam Regional Park Alam Perigord-Limousin, di selatan-barat Perancis (Gbr. 2). Sekitar 80 air situs yang diidentifikasi di daerah 5 • 5 km study. Kolam alami depresi lapangan dan tua (c. abad ke-17) tambak. Perikanan Kegiatan berhenti pada akhir abad ke-19. The Dronne sungai dan dua anak-anak sungainya (Gbr. 2) adalah air hanya berjalan di daerah ini. Bullfrog DETEKSI PERKIRAAN Kehadiran katak Amerika pertama kali terdeteksi di wilayah ini di awal 90-an. Untuk memperkirakan probabilitas deteksi katak dengan Metode survei lapangan tradisional, sebuah penelitian yang dilakukan di delapan kolam di mana keberadaan kodok telah dikonfirmasi untuk beberapa tahun (DEJEAN 2008). Kolam tersebut sampel pada empat kali (8, 20, 27 dan tanggal 29 Juni 2006, metode yang dijelaskan di bawah). Kondisi cuaca (suhu dan angin) selama hari-hari survei ini adalah optimal untuk Kegiatan bullfrog di selatan-barat Perancis (Ficetola et al. 2007a). Probabilitas deteksi dan situs hunian dimodelkan sesuai untuk MacKenzie et al. (2006). Kami menguji dua model (probabilitas deteksi entah konstan atau bervariasi antara empat kali sampling) untuk setiap kategori bullfrog (remaja, laki-laki dan perempuan) dengan kehadiran software 3.1 (MacKenzie et al. 2006). Evaluasi kinerja relatif themodels didasarkan pada Akaike Information Kriteria (AIC) (Burnham & Anderson 2002), dan model dengan rendah AIC dianggap calon yang lebih baik dibandingkan dengan yang lebih tinggi AIC. PROGRAM PEMBERANTASAN Staf dari PNR memutuskan untuk menerapkan program pemberantasan 2005. Empat puluh sembilan kolam dipilih (sebagian besar situs yang tidak dipilih dalam daerah penelitian adalah kolam kecil dengan air sementara, DEJEAN 2008), termasuk delapan kolam yang dijelaskan di atas, yang disurvei untuk menentukan probabilitas deteksi katak. Metode pemberantasan termasuk penghapusan massa telur, kecebong perangkap dan penembakan remaja dan dewasa (DEJEAN 2008). Pada akhir musim semi dan musim panas tahun 2006, 601 katak terdeteksi dan ditembak di 32 kolam, dari 515 ini adalah remaja, 74 adalah laki-laki dan 12 adalah perempuan. Pada tahun 2007, 412 orang ditembak di 19 kolam, termasuk 339 remaja, 59 laki-laki dan 14 betina. Pada tahun 2008, 334 orang ditembak dalam tujuh kolam, termasuk 313 remaja, 14 laki-laki dan tujuh perempuan (Guibert, DEJEAN & Hippolyte 2010). SURVEI LAPANGAN TRADISIONAL Survei dilakukan pada tahun 2006 (delapan kolam, lihat di atas untuk metode) dan 2008 (49 kolam, 16-20 Juni) dengan bantuan dari herpetologis terampil: (i) Pada siang hari, pertemuan visual yang Survei dilakukan di perbatasan masing-masing kolam (sampai 1 jam tergantung pada ukuran kolam): garis pantai diikuti dan diselidiki menggunakan teropong, untuk mendeteksi orang dewasa dan remaja. Itu air dekat garis pantai juga mencari massa telur dan berudu. (ii) Dari sekitar 10:00 (sunset) hingga 02:00, kolam dikunjungi lagi, dan survei panggilan dilakukan. Itu kolam didekati diam-diam ke jarak sekitar 50 m dari tepi kolam. Setelah mencapai posisi survei, surveyor menunggu selama 5 menit sebelum melakukan survei pendengaran. masing-masing Survei dilakukan untuk maksimal 15 menit dan disimpulkan segera setelah panggilan katak terdeteksi. Edna SURVEY Strategi sampling yang digunakan untuk deteksi bullfrog dengan Edna diikuti protokol seperti yang dijelaskan oleh Ficetola et al. (2008). Contoh terjadi pada periode waktu yang sama dengan survei tradisional (16-20 Juni 2008), dan tiga 15-mL sampel air yang dikumpulkan dari berbagai bagian dari setiap kolam di mana spesies ini kemungkinan besar hadir (yaitu terutama di daerah yang kaya vegetasi akuatik). Untuk setiap kolam, sampel dikumpulkan pada hari yang sama. Segera setelah pengumpulan, solusi terdiri dari 15 ml natrium asetat 3 Mand 33 mL mutlak etanol ditambahkan pada sampel air dan tabung kemudian disimpan pada) 20 C sampai ekstraksi DNA. Sebanyak 147 sampel air dikumpulkan dari 49 kolam. Semua sampel untuk survei Edna yang disusun oleh air jernih. Metode ekstraksi DNA dan amplifikasi yang diadaptasi dari Ficetola et al. (2008). Campuran disentrifugasi pada 9400 g untuk 1 jam pada 60 C untuk memulihkan DNA and/ atau sisa-sisa sel. DNA dari pelet yang dihasilkan diekstraksi menggunakan QIAmp Darah dan Tissue Ekstraksi Kit (GmbH, Qiagen, Hilden, Jerman), berikut instruksi pabrik. Ekstraksi DNA dilakukan di sebuah ruangan yang didedikasikan untuk sampel DNA yang rusak. kontrol ekstraksi secara sistematis dilakukan untuk memantau kemungkinan kontaminasi. Bullfrog DNA diamplifikasi dengan primer spesifik (Ficetola et al. 2008). Amplifikasi DNA dilakukan dalam volume akhir 25 lL, menggunakan 3 lL ekstrak DNA sebagai template. Tiga ulangan PCR dilakukan per sampel DNA. Campuran amplifikasi berisi 1 U Ampli Taq Emas DNA Polymerase (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 10 mM Tris-HCl, 50 mm KCl, 2 mM MgCl2, 0.2 mM masing-masing dNTP, 02 lm masing-masing primer dan 0.005 mg albumin serum bovine (BSA, Roche Diagnostics, Basel, Swiss). Setelah 10 menit pada 95 C (aktivasi Taq), siklus PCR dilakukan sebagai berikut: 55 siklus 30 s pada 95? C, 30 s pada 61 C. produk PCR divisualisasikan menggunakan elektroforesis pada gel agarosa 2%. Negatif (Air UHQ) serta sampel positif (DNA diekstraksi dari Amerika bullfrog jaringan) secara sistematis ditambahkan selama PCR langkah. Hasil SURVEI LAPANGAN TRADISIONAL Themodels dengan probabilitas deteksi konstan memberikan yang lebih baik penjelasan data survei yang diamati dikumpulkan pada tahun 2006 untuk setiap kategori bullfrog (Tabel 1): probabilitas deteksi 0.80 ± 0.73 di remaja, 0.73 ± 0.80 pada laki-laki dan 0.27 ± 0.081 pada wanita, masing-masing. Kehadiran katak terdeteksi pada tujuh dari 49 kolam yang disurvei pada tahun 2008 (kejadian = 0.143). berudu adalah diamati selama diurnal survei pertemuan visual dalam tiga kolam sementara laki-laki yang terdeteksi oleh survei panggilan nokturnal dalam empat kolam lainnya (Gbr. 1 dan Tabel 2). Tabel 1. Model seleksi untuk bullfrog probabilitas deteksi inferensi menggunakan metode visual yang tradisional (pertemuan dan survei memanggil) untuk deteksi amfibi Model AIC Model Nb kemungkinan parameter Juvenil P konstan 34.02 1.00 2 P Variable 34.99 0.62 5 Pria P konstan 38.79 1.00 2 P Variable 43.25 0.11 5 wanita P konstan 38.79 1.00 2 P Variable 38.81 0.99 5 Aic, Akaike Information Criterion; Nb, nomor. Edna SURVEY Bullfrog Edna berhasil diperkuat dalam sampel air dikumpulkan dalam 38 dari 49 kolam. Sinyal DNA bullfrog positif diperoleh untuk ketiga ulangan di 22 kolam, untuk dua tiga ulangan di sembilan kolam dan salah satu dari tiga ulangan dalam tujuh kolam. Tiga ulangan PCR dilakukan untuk masing-masing Ekstrak DNA (yaitu total sembilan PCR untuk setiap kolam). Itu Keberhasilan amplifikasi DNA katak rata-rata keseluruhan adalah 0.53 ± 0.03 (min: 3/1; max: 03/03, N = 38). Survei Edna menghasilkan terjadinya bullfrog dari 0.775 (Gbr. 1b dan Tabel 2). MEMBANDINGKAN TRADISIONAL DAN Edna SURVEI Hasil positif diperoleh untuk survei Edna dari semua tujuh kolam di mana katak terdeteksi menggunakan tradisional metode survei (Tabel 2). Keberhasilan amplifikasi dalam ini kolam adalah 0.62 ± 0.06 (min: 3/9; max: 09/08, N = 7). Hal ini tidak mungkin untuk menyimpulkan hubungan antara keberhasilan amplifikasi Edna dan kepadatan bullfrog karena survei tidak dirancang untuk memperkirakan parameter ini. Tidak termasuk tujuh kolam serta 11 kolam di mana katak tidak terdeteksi (menggunakan baik tradisional dan Edna survei), keberhasilan amplifikasi adalah 0.52 ± 0.03 (min: 09/01; max: 9/9) di 31 kolam yang tersisa. Tidak ada kehadiran bullfrog terdeteksi pada nomor kolam # 41 dari menggunakan surveymethod tradisional, sedangkan dua dari tiga sampel air dan lima dari sembilan PCR yang positif (Tabel 2). Demikian pula, empat kolam (# 13, 19, 20 dan 21) menunjukkan amplifikasi DNA katak dalam semua ulangan sampel air (tujuh sembilan PCR positif) sementara tidak ada kehadiran bullfrog terdeteksi di kolam ini menggunakan metode survey tradisional. Secara keseluruhan, metode Edna menunjukkan terjadinya bullfrog di 38 dari 49 kolam (0.775) yang lebih dari lima kali lebih tinggi daripada yang ditemukan dalam survei tradisional (tujuh dari 49; 0.143). Diskusi Pemahaman yang tepat distribusi spesies kunci persyaratan untuk pengelolaan konservasi, terutama ketika spesies fokus adalah invasif (Magurran 2003; Harvey, Qureshi & MacIsaac 2009). Kemampuan untuk mendeteksi spesies dengan kepadatan rendah sangat mempengaruhi keputusan manajemen (Mehta et al. 2007), membuat pengembangan metode untuk meningkatkan deteksi probabilitas prioritas tinggi. Dalam studi ini, kami mengambil keuntungan dari tindakan kontrol untuk mengelola invasif Amerika bullfrog di NaturalRegional Taman Pe'rigord-Limousin ke membandingkan survei lapangan tradisional dan survei Edna. Kontrol tindakan yang dilakukan sejak tahun 2006 dianggap sebagai efektif karena 35 badan air yang terdeteksi sebagai terjajah di 2006, 19 tahun 2007 dan tujuh pada tahun 2008 (Guibert, DEJEAN & Hippolyte 2010). Namun, jika tren yang diamati dalam kejadian berkorelasi dengan penurunan ukuran populasi, ada risiko tinggi lebih memperkirakan keberhasilan tindakan ini karena sumur diketahui hubungan antara deteksi dan kepadatan amfibi (misalnya Tanadini & Schmidt 2011). Metode Edna merupakan alat yang menjanjikan dalam ekologi (Ficetola et al 2008.); Namun, penting untuk menilai efisiensi dengan membandingkan metode survei yang berbeda untuk menentukan reliabilitas relatif mereka. Bullfrog DETEKSI DIBANDINGKAN DENGAN TRADISIONAL SURVEY Keandalan survei amfibi, seperti halnya spesies lain metode deteksi, dapat dikompromikan oleh kemungkinan positif palsu (I kesalahan Type, spesies terdeteksi mana tidak hadir) dan / atau palsu negatif (II kesalahan Type, spesies tidak terdeteksi mana hadir). Deteksi Bullfrog didasarkan panggilan, berudu dan tekad menumbuhkan. Spesies ini adalah mudah untuk mengidentifikasi antara amfibi asli lain dari mempelajari daerah, dan kami menganggap bahwa kemungkinan palsu positif ditutup null. Di sisi lain, bullfrog tidak terdeteksi di mana itu hadir adalah masalah klasik dalam monitoring populasi amfibi (lihat Dodd 2010 untuk review) terjadinya .Amphibian atau kelimpahan sangat tergantung pada pendeteksian spesies, yang berbeda dengan banyak faktor; ini termasuk tanggal dan waktu hari, meteorologi kondisi, ukuran populasi dan pengalaman pengamat (Crouch & Paton 2002; Genet & Sargent 2003; Schmidt & Pelet 2010; Tanadini & Schmidt 2011). Survei menyebut merupakan salah satu metode yang paling populer (misalnya Pelet & Schmidt 2005; de Solla et al. 2005; Weir et al. 2005), karena vokalisasi laki-laki untuk menarik betina dengan mudah diidentifikasi, membuat deteksi dan identifikasi mereka relatif sederhana ketika kondisi cuaca yang menguntungkan (misalnya Pellet & Schmidt 2005). Di wilayah Pe'rigord-Limousin, bullfrog pendeteksian (menggabungkan panggilan dan survei pertemuan visual) mirip dan agak tinggi untuk remaja dan laki-laki (0.80 ± 0.073 dan 0.73 ± 0.080, masing-masing) sementara itu menurun menjadi 0.27 ± 0.081 untuk wanita. Reproduksi perbedaan biologi dan perilaku antara tahap kehidupan bisa menjelaskan hasil ini (misalnya tidak ada aktivitas panggilan dan wilayah pertahanan pada wanita, Ryan 1980). Pelet & Schmidt 2005 menunjukkan bahwa untuk katak umum (Bufo bufo), sebuah amfibi kolam-peternakan, di Sedikitnya enam kunjungan (15 menit masing-masing) yang diperlukan untuk menyimpulkan Kehadiran spesies dengan keyakinan 95%. Jika penurunan density bullfrog 2006-2008 mengarah pada deteksi berkurang probabilitas, fenomena ini dapat diimbangi oleh Upaya pengambilan sampel meningkat (yaitu jumlah kunjungan per situs). Itu Perbedaan besar dalam terjadinya kodok memperkirakan pada tahun 2008 antara dua metode (tradisional vs Edna) menyarankan bahwa distribusi bullfrog yang diremehkan menggunakan survei lapangan tradisional. Setelah hasil ini, staf dari PNR Pe'rigord-Limousin adalah sangat termotivasi untuk melakukan Survei lapangan baru (lebih dari lima kunjungan per situs) pada 38 kolam diidentifikasi sebagai bullfrog positif dengan Edna. katak yang terdeteksi dalam tujuh kolam sebelumnya, dan di 11 air 'baru' tubuh. Terjadinya diperkirakan katak sehingga mencapai 0.47 dengan upaya pengambilan sampel ini kuat, dalam satu set kolam yang Edna Metode diidentifikasi sebagai kodok yang positif. Goldberg et al. (2011) menunjukkan sensitivitas metode Edna dalam kasus Penelitian yang melibatkan karper Asia di Amerika Utara, dengan membandingkannya dengan memancing klasik. Pada kepadatan ikan mas terendah, hanya eDNA mampu mendeteksi keberadaan ikan mas. Salah satu ikan mas terdeteksi dalam satu kolam renang setelah 93 orang-hari usaha penangkapan yang termotivasi dan ditargetkan oleh penemuan ikan mas Edna. DETEKSI PROBABILITAS DENGAN Edna SURVEY Keandalan metode genetik dapat dikompromikan oleh kemungkinan positif palsu dan / atau negatif (tipe I dan II kesalahan, lihat di atas), yaitu, non-kekhususan dari primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA, kontaminasi atau DNA berlarut-larut ketekunan setelah kematian organisme, pengambilan sampel yang buruk atau efisiensi protokol miskin (Sayang & Mahon 2011). Protokol yang digunakan telah terbukti handal dalam studi sebelumnya (Ficetola et al 2008.): Sebelum analisis Edna, primer keandalan, ketahanan dan spesifisitas diuji, pertama di silico [menggunakan software ecopcr (Taberlet et al. 2007)] dan kemudian pada berkualitas tinggi DNA (diekstraksi dari jaringan sampel), dan PCR kondisi yang optimal (Ficetola et al. 2008). Karena kelangkaan DNA dalam sampel air, analisis itu dilakukan dengan tindakan pencegahan yang sama seperti yang digunakan untuk kuno Studi DNA untuk mengurangi kontaminasi dan berkualitas rendah DNA hasil (Taberlet et al 1996;. Cooper & Poinar 2000). Ini berarti bahwa DNA diekstraksi di ruang khusus untuk langka DNA, sampel mock tanpa sampel DNA dan positif dianalisis secara paralel, jumlah siklus PCR meningkat, analisis dilakukan pada beberapa sampel lapangan dan tiga PCR ulangan per sampel dilakukan. Berdasarkan tiga sampel per kolam, keberhasilan amplifikasi adalah 0.37 ± 0.1 di kolam di mana katak hadir dengan kepadatan rendah dan 0.79 ± 0.08 di kolam di mana katak hadir di tinggi kepadatan (Ficetola et al. 2008). Dalam penelitian ini,Tingkat amplifikasi adalah 0.53 ± 0.03. Masih terlalu dini untuk menyimpulkan kuantitatif (yaitu kelimpahan atau kepadatan) informasi dari eDNAsurvey hasil, tetapi tingkat amplifikasi dapat berguna dengan akhir di masa depan. Beberapa kolam dalam wilayah studi tidak dapat dianggap menjadi unit diskrit, karena mereka terhubung dengan sungai kecil (Gbr. 1). Dengan demikian mungkin bahwa DNA bergerak dari satu situs ke situs lain, yang mengarah ke positif palsu (bullfrog Edna terdeteksi di Bullfrog kolam gratis). Namun, dalam penelitian kami, Edna mengungkapkan kehadiran katak di kolam 32 dan 13 (sekitar 1 km terpisah, Gambar. 1), dan tidak di kolam 12 dan 15 yang terletak di antara mereka di anak sungai yang sama. Perhatikan bahwa tidak ada aliran air di streaming pada saat ini tahun, yang membatasi eDNAdispersal. Akhirnya, katak canmove dari satu kolam ke yang lain, meninggalkan Edna dalam kolam kosong pada saat sampling, yang akan menyebabkan pada gilirannya positif palsu. Jarak rata-rata antara kolam yang berdekatan di area sampling lebih rendah dari kodok dewasa potensi penyebaran (Ingram & Raney 1943; Willis, Moyle & Baskett 1956). Namun, dewasa dan remaja penyebaran disimpulkan dengan radiotracking dan pit-jatuh metode perangkap di selatan-barat Perancis (Berroneau, Detaint & Coic 2007) menunjukkan bahwa kedua tahap kehidupan tinggal di lokasi air selama Masa studi Juni. Selain itu, kegigihan Edna di air telah diuji (DEJEAN et al. 2011) dan bullfrog Edna terdeteksi hanya untuk maksimal 2 minggu setelah penghapusan hewan sumber. Dengan demikian sangat mungkin bullfrog yang hadir atau telah hadir maksimal 2 minggu sebelum waktu sampling air dilakukan, yang selanjutnya membatasi kemungkinan kesalahan tipe I. Penggunaan Edna sebagai alat survei ekologi dalam perkembangan fase. Deteksi diandalkan vertebrata air adalah dikonfirmasi di lahan basah (Ficetola et al. 2008), di sebuah sungai besar dan sistem kanal (studi risiko invasi Laurentian Great Lakes wilayah dengan Carp Asia, Jerde et al. 2011) dan stream (inventarisasi rahasia katak Rocky Mountain ekor, Ascaphus Montanus, dan salamander raksasa Idaho, Dicamptodon aterrimus, di wilayah utara-barat Amerika Serikat, Goldberg et al. 2011). Studi-studi ini menunjukkan pendeteksian yang lebih tinggi untuk spesies akuatik yang langka dan / atau rahasia, pada semua tahap kehidupan dan di kepadatan rendah. Di kolam-peternakan amfibi (studi ini), deteksi dengan metode tradisional sangat sensitif terhadap meteorologi kondisi dan sering terbatas dalam musim (short stay di air dewasa breeding). Pengambilan sampel air untuk Edna bisa dilakukan apapun kondisi cuaca dan untuk lebih lama periode waktu karena individu yang lebih samar (misalnya berudu) tinggal di air. Dalam populasi kodok lain diperkenalkan (32 kolam terjajah, Loir et Cher, Central Perancis, Gambar. 1), a estimasi awal biaya survei tradisional dan Edna menunjukkan bahwa metode Edna adalah 2Æ5 kali lebih murah dan 2.5 kali memakan waktu kurang dari survei tradisional waktu (berdasarkan pada 2-orang waktu lapangan dan analisis molekuler lengkap) (Michelin, Heckly & Rigaux 2011). Sensitivitas Edna di taksa dan lingkungan masih harus ditentukan. Metode ini efisien untuk vertebrata persediaan dalam lingkungan air tawar, dengan langka dan / atau spesies rahasia, dengan kepadatan rendah dan pada beberapa tahap kehidupan. Ini Metode terutama menjanjikan untuk kelompok taksonomi lainnya (misalnya mikroorganisme, tanaman) dan lingkungan lainnya (misalnya tanah).